86595763-Compte-Rendu-Du-Tp-de-Microbiologie

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Année 2002-2003
Compte rendu du stage de Tp de
Microbiologie

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Préparation des milieux et du matériel
L’étude des bactéries a connu son plein développement à partir du moment où furent mises au point des
méthodes permettant de les cultiver, les isoler, et de les identifier. Ces différentes opérations
nécessitent l’emploi de milieux de culture.
Principales caractéristiques d’un milieu de culture
Les microorganismes doivent trouver dans le milieu de culture et son atmosphère tous les éléments
chimiques les constituant, sous une forme appropriée.
Un bon milieu doit :
Etre stérile
Etre nutritif : doit contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigés pour la
croissance et l’entretien des microorganismes.
Contenir une quantité d’eau suffisante pour permettre le métabolisme bactérien.
Avoir un pH convenable.
Rq : Un milieu contenant uniquement ce qui est nécessaire aux microorganismes est dit milieu minimum.
Classification des milieux de culture
Les milieux de culture sont classés en fonction de leur composition ou de leur utilisation.
a) Classification selon la composition.
1. Milieux naturels ou empiriques
Milieux complexes de composition mal définie. Leur origine est soit animale (extraits de viande,
peptone), soit végétale (pomme de terre, levure).
2. Milieux synthétiques
Milieux composés de substances chimiques exactement définies
3. Milieux semi synthétiques
Milieux synthétiques additionnés d’un produit naturel
b) Classification selon l’utilisation
1. Milieu usuels = milieu de base
Milieu d’un emploi aussi général que possible. Il n’existe cependant pas de milieu de culture universel
2. Milieu d’isolement
Les milieux d’isolement peuvent être :
Des milieux de base
Des milieux enrichis de produits biologiques
Des milieux électifs : Ce sont des milieux de culture permettant
un développement particulièrement abondant de certains germes.
Des milieux sélectifs (ou d’enrichissement) : Ce sont des milieux
dans lesquels on incorpore un inhibiteur chimique. Celui-ci,
judicieusement choisi, entrave le développement de la plupart des
bactéries excepté celui de l’espèce recherchée. Ces milieux
permettent donc d’isoler une espèce bactérienne au milieu d’un
mélange de germes.
3. Milieu d’identification
Ces milieux permettent la mise en évidence des caractères biochimiques et donc de résoudre les
problèmes d’identification différentielle qui se posent entre des espèces ou des genres voisins.

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c) Classification selon leur présentation
1. Milieux liquides
Ce sont soit des bouillons nutritifs contenant des produits carnés ou protéiques, soit des solutions
riches en produits synthétiques. Dans les deux cas la gélose est totalement absente.
La croissance microbienne est réalisée dans des tubes, des ballons ou des erlenmeyers. Elle est suivie
par turbidimétrie : un milieu limpide au départ devient de plus en plus trouble lorsqu’un microorganisme
se développe.
2. Milieux solides
Les milieux nutritifs solides peuvent être identiques aux précédents mais ils contiennent de la gélose. Si
il y a plus de 1% d’agar on parle de milieu solide, si il y a moins de 1% d’agar on parle de milieu semi solide.
Ces milieux peuvent être répartis en boîtes de pétri, dans des tubes à gélose molle prise en culot, etc.
La croissance microbienne se déroule en surface ou en profondeur et est suivie par observation de
l’augmentation de la taille des colonies respectivement aérobies et anaérobies. Une cellule initiale se
multiplie et donne une descendance de plusieurs millions d’individus tous identiques, formant une colonie.
Préparation des milieux de culture
Sachant que de la préparation des milieux de culture dépend les résultats de l’analyse microbiologique,
un défaut de fabrication, une stérilisation mal conduite, risquent de perturber le travail. Il faudra donc
apporter un grand soin à leur fabrication.
Les milieux de culture existent aujourd’hui sous trois formes, soit, du plus coûteux au plus économique :
- Le prêt à l’emploi
- Le prêt à couler
- En poudre
Durant ce Tp nous avons essentiellement utiliser des milieux en poudre du fait de leur moindre coût, ce
sont soit un mélange des constituants de base, soit un des éléments de base, dont le fabricant indique la
dose à peser pour un volume final de milieu.
Les différentes étapes de la préparation de ces milieux consistaient en :
- La pesée
- La dissolution des ingrédients
- La mesure du pH
- La répartition
- La stérilisation des milieux (autoclave 121°C pendant 20 min)
Rq : L’agar étant un composé insoluble à froid, il sera incorporé après la dissolution des ingrédients et la
mesure du pH.

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Les milieux utilisés durant ce Tp, leur rôle et leur préparation
Durant ce Tp nous avons utilisé :
Un milieu empirique sous forme solide: Gélose nutritive (GN)
Un milieu empirique sous forme liquide : Bouillon nutritif (BN)
Deux milieux sélectifs : Milieu à l’éosine et bleu de méthylène (EMB), Milieu Malt agar (MA)
De l’eau physiologique
Gélose nutritive (GN):
Relativement simplifiée, sa formulation apporte les éléments nutritifs nécessaires à la croissance d’une
grande variété de germes non exigeants. Elle est utilisée pour la culture et la numération des
microorganismes ne présentant pas d’exigences particulières.
Elle est constituée :
- extrait de levure
- bouillon nutritif (nutrient broth)
- glucose
- agar
Nous avons pesé 20g de BN, 3g d’extrait de levures, 5g de glucose, que nous avons placés dans un erlen
de 2L et auxquels nous avons ajouté 1L d’eau déminéralisée et placé sous agitation avec un barreau
aimanté afin de dissoudre les différents constituants. Nous avons alors vérifié que le pH se situait bien
dans une gamme comprise entre 7 et 7.5. C’est donc après la dissolution des différents éléments du
milieu et ajustage du pH que nous avons incorporé les 15g d’agar. Nous avons alors bouché l’encolure de
l’erlen avec du coton cardé et placé une feuille d’aluminium autour avant de stériliser le milieu à
l’autoclave à 121°c pendant 20 min.
Bouillon nutritif (BN) :
Le bouillon nutritif contient exactement les mêmes constituants que la gélose nutritive, excepté le fait
qu’on n’ajoute pas d’agar puisque c’est un milieu liquide. Il est donc constitué de :
- extrait de levure
- bouillon nutritif (nutrient broth)
- glucose
Sa préparation est identique à celle de la gélose nutritive.
Gélose EMB (éosine methylen bleu) :
La gélose EMB est constituée d’éosine Y et de bleu de méthylène qui sont des agents faiblement
sélectifs. Ils n’inhibent que partiellement le développement des microorganismes gram positifs tels que
les Streptocoques fécaux. De plus ces colorants assurent la différenciation entre les germes lactose
positifs et les germes lactose négatifs, lorsque le milieu est lactosé.
Nous avons pesé 18.75g afin de préparer 500 mL de ce milieu, auxquels nous avons ajouté 500 mL d’eau
déminéralisée. On a alors ajusté le pH à 6.8-7 à l’aide de KOH concentré et stérilisé à 121°c pendant 20
min suivant le même protocole que précédemment.

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Gélose Malt agar :
Elle est constituée :
- extrait de malt
- extrait de levure
- glucose
- agar
Nous avions à notre disposition sous forme de poudre la base du milieu malt agar qui contenait tous les
constituants sauf l’extrait de levure et le glucose. Le fabricant indiquait qu’il fallait peser 45g pour
préparer un litre. Nous voulions préparer 500 mL, nous pesions par conséquent 22.5g sur une feuille
d’aluminium. Nous avons également pesé 1.25g d’extrait de levure et 5g de glucose. Après avoir pesé tous
les constituants nous les avons transférés dans un erlen d’un litre et ajouté 500 mL d’eau déminéralisée.
Nous avons ensuite rajouté 0.25g de Cloramphénicol avant de stériliser à 121°C pendant 20 min.
La sélection des levures se réalise par l’emploi du chloramphénicol
L’eau physiologique :
Elle est obtenue par dissolution de 9g de Chlorure de sodium (NaCl) par litre d’eau distillée. Elle
constitue un milieu isotonique qui permettra la dissolution des microorganismes tout en maintenant la
différence de pression osmotique de part et d’autre de la membrane plasmique évitant ainsi la lyse.
Après stérilisation nous avons procédé à l’étape de répartition des milieux. Nous avons coulé les géloses
de façon stérile à proximité de la flamme du bec Bunzen.